Змискиот отров содржи ензими кои ги хидролизираат карбоксилестерските врски.Супстратите за хидролиза се фосфолипиди, ацетилхолин и ароматичен ацетат.Овие ензими вклучуваат три вида: фосфолипаза, ацетилхолинестераза и ароматична естераза.Аргинин естеразата во змискиот отров може да хидролизира и синтетички аргинин или лизин, но главно ги хидролизира протеинските пептидни врски во природата, па затоа припаѓа на протеазата.Ензимите кои се дискутирани овде делуваат само на естерски супстрати и не можат да дејствуваат на која било пептидна врска.Меѓу овие ензими, биолошките функции на ацетилхолинестеразата и фосфолипазата се поважни и се целосно проучени.Некои змиски отрови имаат силна активност на ароматична естераза, која може да хидролизира п-нитрофенил етил естер, а - или Р-нафтален ацетат и индол етил естер.Сè уште не е познато дали оваа активност е произведена од независен ензим или познат несакан ефект на карбоксилестеразата, а камоли неговото биолошко значење.Кога отровот на Agkistrodon halys Japonicus бил реагиран со p-нитрофенил етил естер и индол етил естер, хидролизатите на p-нитрофенол и индол фенол не биле пронајдени;Напротив, ако овие естри реагираат со змиски отров од подвидовите на кобра Zhoushan и змиски отров Bungarus multicinctus, тие брзо ќе се хидролизираат.Познато е дека овие отрови на кобра имаат силна активност на холинестераза, која може да биде одговорна за хидролиза на горенаведените супстрати.Всушност, Меклин и сор.(1971) објави дека многу отрови од змии кои припаѓаат на семејството Кобра може да хидролизираат индол етил естер, нафталин етил естер и бутил нафталан естер.Овие змиски отрови потекнуваат од: кобра, црна кобра со врат, кобра со црна усна, златна кобра, египетска кобра, кралска кобра, златна кобра мамба, црна мамба и бела мамба со усни (D. aw сè уште ја познава источната ромболна змија ѕвечарка
Змискиот отров може да хидролизира метил индол етил естер, кој е супстрат за одредување на активноста на холинестеразата во серумот, но овој змиски отров не покажува активност на холинестераза.Ова покажува дека постои непозната естераза во отровот на кобрата, која се разликува од холинестеразата.За да се разбере природата на овој ензим, потребна е дополнителна работа на сепарација.
1, Фосфолипаза А2
(I) Преглед
Фосфолипазата е ензим кој може да хидролизира глицерил фосфат.Постојат 5 видови на фосфолипаза во природата, имено фосфолипаза А2 и фосфолипаза
А., фосфолипаза Б, фосфолипаза Ц и фосфолипаза Д. Змискиот отров главно содржи фосфолипаза А2 (PLA2), неколку отрови од змии содржат фосфолипаза Б, а други фосфолипази главно се наоѓаат во животинските ткива и бактерии.Сл. 3-11-4 го покажува местото на дејство на овие фосфолипази при хидролиза на подлогата.
Меѓу фосфолипазите, PLA2 е повеќе проучуван.Можеби е најпроучениот ензим во отровот од змии.Нејзиниот супстрат е естерската врска на втората позиција на Sn-3-глицерофосфат.Овој ензим нашироко се наоѓа во отровот од змии, отровот на пчелите, отровот на скорпијата и животинските ткива, а PLA2 е изобилен во четири фамилијарни отрови од змии.Бидејќи овој ензим ги крши црвените крвни зрнца и предизвикува хемолиза, тој се нарекува и „хемолизин“.Некои луѓе ја нарекуваат и PLA2 хемолитична лецитиназа.
Лудик најпрво открил дека отровот од змија може да произведе хемолитичко соединение со дејство на лецитин преку ензими.Подоцна, Делезен и сор.докажано дека кога отровот на кобра делува на коњскиот серум или жолчка, тој формира хемолитичка супстанција.Сега е познато дека PLA2 може директно да делува на фосфолипидите на мембраната на еритроцитите, уништувајќи ја структурата на мембраната на еритроцитите и предизвикувајќи директна хемолиза;Може да делува и на серум или додаден лецитин за да произведе хемолитички лецитин, кој делува на црвените крвни зрнца за да произведе индиректна хемолиза.Иако PLA2 е изобилен во четирите фамилии на отрови од змии, содржината на ензими во различни отрови од змии е малку поинаква.Змија ѕвечарка (C
Змискиот отров покажа само слаба активност на PLA2.Табелата 3-11-11 ја илустрира споредбата на активноста на PLA2 на 10 главни отрови на отровни змии во Кина.
Табела 3-11-11 Споредба на активностите на фосфолипаза VIII на 10 отрови од змии во Кина
Змиски отров
Ослободување на маснотии
Алифатична киселина,
Cjumol/mg)
Хемолитичка активност CHU50/^ g * ml)
Змиски отров
Ослободете масни киселини
(^раол/мг)
Хемолитичка активност „(HU50/ftg * 1111)
Најанаја атра
9. 62
единаесет
Микрацефална офис
пет точки една нула
калиспалас
8. 68
две илјади и осумстотини
gracilis
V, акутус
7. 56
* * #
Офиофаг Хана
три поени осум два
сто и четириесет
Bnugarus fasctatus
7,56
двесте и осумдесет
B. multicinctus
еден поен девет шест
двесте и осумдесет
Випер и русели
седум точки нула три
Т, мукроскваматус
еден поен осум пет
Сијаменсис
T. stejnegeri
0. 97
(2) Одделување и прочистување
Содржината на PLA2 во отровот од змија е голема и е стабилна на топлина, киселина, алкали и денатурант, така што лесно се прочистува и се одвојува PLA2.Вообичаениот метод е прво да се изврши филтрација со гел на суровиот отров, потоа да се изврши хроматографија за размена на јони, а следниот чекор може да се повтори.Треба да се напомене дека сушењето со замрзнување на PLA2 по хроматографијата со јонска размена не треба да предизвика агрегација, бидејќи процесот на сушење со замрзнување често ја зголемува јонската сила во системот, што е важен фактор што предизвикува агрегација на PLA2.Покрај горенаведените општи методи, усвоени се и следните методи: ① Велс и сор.② Аналогот на супстратот на PLA2 беше користен како лиганд за афинитетна хроматографија.Овој лиганд може да се поврзе со PLA2 во змиски отров со Ca2+.ЕДТА најчесто се користи како елуент.Откако ќе се отстрани Ca2+, афинитетот помеѓу PLA2 и лигандот се намалува и може да се дисоцира од лигандот.Други користат 30% органски раствор или 6mol/L уреа како елуент.③ Беше изведена хидрофобна хроматографија со PheiilSephar0SeCL-4B за да се отстрани трагата на PLA2 во кардиотоксинот.④ Анти PLA2 антителата се користеа како лиганд за да се изврши афинитетна хроматографија на PLA2.
Досега се прочистени голем број змиски отров ПЛАЗ.Ту и сор.(1977) го наведоа PLA2 прочистен од змиски отров пред 1975 година. Во последниве години, секоја година се пријавени голем број написи за одвојување и прочистување на PLA2.Овде, ние се фокусираме на одвојување и прочистување на PLA од кинески научници.
Чен Јуанконг и сор.(1981) одвои три видови PLA2 од отровот на Agkistrodon halys Pallas во Жеџијанг, кои може да се поделат на кисели, неутрални и алкални PLA2 според нивните изоелектрични точки.Според неговата токсичност, неутралниот PLA2 е потоксичен, кој е идентификуван како пресинаптички невротоксин Агкистродотоксин.Алкалниот PLA2 е помалку токсичен, а киселиот PLA2 нема речиси никаква токсичност.Ву Ксијангфу и сор.(1984) ги спореди карактеристиките на три PLA2, вклучувајќи молекуларна тежина, состав на аминокиселини, N-терминал, изоелектрична точка, термичка стабилност, ензимска активност, токсичност и хемолитичка активност.Резултатите покажале дека тие имале слична молекуларна тежина и топлинска стабилност, но имале значителни разлики во други аспекти.Во однос на ензимската активност, киселинската ензимска активност беше повисока од алкалната ензимска активност;Хемолитичкиот ефект на алкалниот ензим врз црвените крвни зрнца на стаорец беше најсилен, проследен со неутрален ензим, а киселинскиот ензим тешко хемолизиран.Затоа, се шпекулира дека хемолитичкиот ефект на PLAZ е поврзан со полнењето на молекулата PLA2.Џанг Џингканг и сор.(1981) направија кристали на Агкистродотоксин.Ту Гуанглианг и сор.(1983) објави дека токсична PLA со изоелектрична точка од 7.6 била изолирана и прочистена од отровот на Vipera rotundus од Fujian и неговите физички и хемиски својства, составот на аминокиселините и низата од 22 амино киселински остатоци во Н. - беа утврдени терминал.Ли Јуешенг и сор.(1985) изолираше и прочисти друг PLA2 од отровот на Viper rotundus во Фуџијан.Подединицата на PLA2 * е 13 800, изоелектричната точка е 10,4, а специфичната активност е 35/xnioI/miri mg. Со лецитин како супстрат, оптималната pH на ензимот е 8,0, а оптималната температура е 65 ° C LD5 инјектиран интравенски кај глувци.Тоа е 0,5 ± 0,12 mg/kg.Овој ензим има очигледни антикоагулантни и хемолитички ефекти.Токсичната молекула PLA2 се состои од 123 остатоци од 18 видови на амино киселини.Молекулата е богата со цистеин (14), аспарагинска киселина (14) и глицин (12), но содржи само еден метионин, а нејзиниот N-терминал е остаток од серин.Во споредба со PLA2 изолиран од Тугуанг, молекуларната тежина и бројот на остатоци од аминокиселини на двата изоензима се многу слични, а составот на аминокиселините е исто така многу сличен, но бројот на остатоците од аспарагинската киселина и пролинот е нешто различен.Отровот од змијата кралска кобра Гуангкси содржи богат PLA2.Шу Јујан и сор.(1989) изолираше PLA2 од отровот, кој има специфична активност 3,6 пати повисока од оригиналниот отров, молекуларна тежина од 13000, состав од 122 остатоци од аминокиселини, изоелектрична точка од 8,9 и добра термичка стабилност.Од набљудувањето на електронскиот микроскоп на ефектот на основната PLA2 врз црвените крвни зрнца, може да се види дека има очигледен ефект врз мембраната на човечките црвени крвни зрнца, но нема очигледен ефект врз црвените крвни зрнца на козата.Овој PLA2 има очигледен забавен ефект врз електрофоретската брзина на црвените крвни зрнца кај луѓето, козите, зајаците и заморчињата.Чен и сор.Овој ензим може да ја инхибира тромбоцитната агрегација индуцирана од ADP, колаген и натриум арахидонска киселина.Кога концентрацијата на PLA2 е 10/xg/ml~lOOjug/ml, тромбоцитната агрегација е целосно инхибирана.Доколку се користат измиени тромбоцити како материјали, PLA2 не може да ја инхибира агрегацијата во концентрација од 20 Mg/ml.Аспиринот е инхибитор на циклооксигеназата, која може да го инхибира ефектот на PLA2 врз тромбоцитите.PLA2 може да ја инхибира тромбоцитната агрегација со хидролизирање на арахидонска киселина за да се синтетизира тромбоксан А2.Конформацијата на растворот на PLA2 произведена од отровот Agkistrodon halys Pallas во провинцијата Жеџијанг беше проучувана со помош на кружен дихроизам, флуоресценција и апсорпција на УВ.Експерименталните резултати покажаа дека конформацијата на главниот синџир на овој ензим е слична на онаа на истиот вид ензим од други видови и родови, конформацијата на скелетот има добра отпорност на топлина, а структурната промена во киселата средина била реверзибилна.Комбинацијата на активаторот Ca2+ и ензимот не влијае на околината на остатоците од триптофан, додека инхибиторот Zn2+ го прави спротивното.Начинот на кој pH вредноста на растворот влијае на ензимската активност е различен од горенаведените реагенси.
Во процесот на прочистување на змискиот отров со PLA2, очигледен феномен е дека отровот од змија содржи два или повеќе врвови на елуција на PLA2.Овој феномен може да се објасни на следниов начин: ① поради постоењето на изозими;② Еден вид на PLA2 е полимеризиран во различни PLA2 мешавини со различни молекуларни тежини, од кои повеќето се во опсег од 9 000-40 000;③ Комбинацијата на PLA2 и други компоненти на змиски отров го комплицира PLA2;④ Бидејќи амидната врска во PLA2 се хидролизира, полнежот се менува.① И ② се вообичаени, со само неколку исклучоци, како што е PLA2 во CrWa/w змиски отров
Постојат две ситуации: ① и ②.Третата состојба е пронајдена во PLA2 во отровот на следните змии: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, палестинска вајпер, песочна вајпер и страшна змија ѕвечарка km.
Резултатот од случајот ④ ја менува брзината на миграција на PLA2 за време на електрофорезата, но составот на аминокиселините не се менува.Пептидите може да се разбијат со хидролиза, но генерално тие сè уште се поврзани заедно со дисулфидни врски.Отровот на источната јама ѕвечарка содржи две форми на PLA2, наречени тип a и тип p PLA2 соодветно.Разликата помеѓу овие два типа на PLA2 е само една амино киселина, односно, глутаминот во едната молекула PLA2 се заменува со глутаминска киселина во другата молекула PLA2.Иако точната причина за оваа разлика не е јасна, генерално се верува дека е поврзана со деаминацијата на PLA2.Ако PLA2 во палестинскиот отров на вајпер се одржува топол со суровиот отров, крајните групи во неговите ензимски молекули ќе станат повеќе од порано.Од C PLA2 изолиран од змиски отров има два различни N-терминали, а неговата молекуларна тежина е 30000. Овој феномен може да биде предизвикан од асиметричниот димер на PLA2, кој е сличен на симетричниот димер формиран од PLA2 во отровот на источната дијамантска змија ѕвечарка. и западна дијамантска ѕвечарка.Азиската кобра е составена од многу подвидови, од кои некои не се многу дефинитивни во класификацијата.На пример, она што порано се нарекуваше подвид Кобра надворешно Касписко, сега е препознаено
Треба да се припише на надворешното касписко море кобра.Бидејќи има многу подвидови и тие се мешаат заедно, составот на отровот од змија варира во голема мера поради различни извори, а содржината на изозимите на PLA2 е исто така висока.На пример, отров од кобра
Најмалку 9 видови на изозими PLA2 од r ^ ll видови беа пронајдени во, и 7 видови на изозими PLA2 беа пронајдени во отровот на подвидот кобра Каспијан.Дуркин и сор.(1981) ја проучувале содржината на PLA2 и бројот на изозими во различни отрови од змии, вклучувајќи 18 отрови од кобри, 3 отрови од мамба, 5 отрови од вајпери, 16 отрови од змии ѕвечарка и 3 отрови од морски змии.Генерално, активноста на PLA2 на отровот на кобрата е висока, со многу изозими.Активноста на PLA2 и изозимите на отровот на вајпер се средни.Активноста на PLA2 на отровот од мамба и отровот од змија ѕвечарка е многу ниска или никаква активност на PLA2.Активноста на PLA2 на отровот од морските змии е исто така ниска.
Во последниве години, не е пријавено дека PLA2 во отровот од змија постои во форма на активен димер, како што е источната ромбофора ѕвечарка (C. змискиот отров содржи тип a и тип P PLA2, и двете се составени од две идентични подединици , а само димеразата има
Активност.Шен и сор.исто така предложи дека само димерот на PLA2 од отровот од змијата е активна форма на ензимот.Проучувањето на просторната структура исто така докажува дека PLA2 на западната дијамантска ѕвечарка постои во форма на димер.Писциворно соединение
Постојат две различни PLA ^ Ei и E2 на змиски отров, во кои 仏 постои во форма на димер, димерот е активен, а неговиот дисоциран мономер е неактивен.Лу Јингхуа и сор.(1980) дополнително ги проучувал физичките и хемиските својства и кинетиката на реакцијата на E. Jayanthi et al.(1989) изолираше основен PLA2 (VRVPL-V) од отровот на вајперот.Молекуларната тежина на мономерот PLA2 е 10000, што има смртоносни, антикоагулантни и едемски ефекти.Ензимот може да полимери со различна молекуларна тежина под услов PH 4,8, а степенот на полимеризација и молекуларната тежина на полимерите се зголемуваат со зголемувањето на температурата.Молекуларната тежина на полимерот генериран на 96 ° C е 53 100, а активноста на PLA2 на овој полимер се зголемува за два
Време на објавување: 18-11-2022 година